?　精確到一個(gè)細胞的拉曼分析—分選—測序（中科院青島能源所供圖）

單細胞拉曼分選耦合測序（RACS-Seq）是剖析環(huán)境菌群功能機制的重要手段，但拉曼分選后單個(gè)細菌細胞基因組的覆蓋度通常低于10%，極大限制了其應用。

近日，中國科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所單細胞中心基于自主研制的RAGE（重力驅動(dòng)單細胞液滴包裹拉曼分選）技術(shù)、儀器和相應試劑盒，首次實(shí)現了精確到一個(gè)細菌細胞、全基因組覆蓋度超過(guò)92%的環(huán)境菌群scRACS-Seq，為環(huán)境微生物組原位代謝功能研究提供了一個(gè)強有力的新工具。

土壤是地球上最重要的生態(tài)系統之一，土壤微生物組的代謝活動(dòng)支撐著(zhù)農業(yè)與畜牧業(yè)，也在地球元素循環(huán)、全球氣候變化中起著(zhù)關(guān)鍵性作用。同時(shí)，土壤菌群也是地球上最多樣與最復雜的微生物組之一，其中大部分微生物尚難以培養，因此，單個(gè)細胞精度的拉曼分析—分選—測序（Single-cell RACS-Seq，簡(jiǎn)稱(chēng)scRACS-Seq）策略，是剖析土壤等環(huán)境菌群之代謝機制的重要手段。

然而，針對環(huán)境菌群的scRACS-Seq一直以來(lái)存在兩大瓶頸，一是難以無(wú)損、快速地獲取具有特定拉曼表型的單個(gè)細胞；二是難以獲得高覆蓋度的單細胞基因組數據。這已經(jīng)成為scRACS-Seq技術(shù)體系在復雜菌群中廣泛應用的關(guān)鍵瓶頸。

針對這一共性難點(diǎn)問(wèn)題，該所單細胞中心荊曉艷、公衍海和徐騰等組成的聯(lián)合攻關(guān)小組，基于前期發(fā)明的RAGE-Seq技術(shù)，從液相拉曼分析穩定同位素底物飼喂的土壤菌群出發(fā)，將特定拉曼表型的細菌單細胞精準分離并包裹到皮升級液滴中，進(jìn)而耦合下游基因組測序。

研究結果表明，土壤菌群中細胞代謝活躍的低豐度物種可經(jīng)耦合重水飼喂與標記的RAGE-Seq精準地識別和分選，其單細胞基因組覆蓋率高達近93％；同樣，基于RAGE-Seq，含類(lèi)胡蘿卜素的土壤微生物細胞能實(shí)現單個(gè)細胞分辨率、高基因組覆蓋度的代謝重建，從而完整、深入地挖掘其類(lèi)胡蘿卜素合成途徑；這些“原位”合成類(lèi)胡蘿卜素的土壤微生物細胞中，既有代謝活躍的，也相當部分是惰性的，表明基于純培養的策略勢必錯失這些代謝惰性的功能微生物，因此“原位”、單細胞精度的功能細胞識別和分離，對于全面、客觀(guān)的菌群功能剖析和資源挖掘具有重要意義。

此外，該工作還通過(guò)組分與狀態(tài)均精確可控的人工菌群，建立了系統且嚴格的scRACS-Seq質(zhì)量評價(jià)與控制體系。

基于該體系，團隊發(fā)現，該技術(shù)能將不同拉曼表型的細菌單細胞從菌群中快速、精準分離，在保證單細胞拉曼光譜質(zhì)量的同時(shí)，分選準確性達100%。此外，以來(lái)自于靶標細胞周?chē)嗟目找旱螢殛幮詫φ?，發(fā)現靶標細胞序列被菌群中其他細胞DNA污染的概率極低。這些工作定量證明了scRACS-Seq的靈敏度、特異性和可靠性。

記者了解到，作為RACS技術(shù)家族的新成員，scRACS-Seq可以在復雜菌群中以單個(gè)微生物細胞的分辨率建立新陳代謝與基因組的聯(lián)系，從而精確回答“誰(shuí)在做什么，為什么”。

在此基礎上，單細胞中心研制和產(chǎn)業(yè)化了單細胞拉曼分選—測序耦合系統（RACS-Seq儀器），以及相應的RAGE芯片和單細胞分析試劑盒。試劑盒包括環(huán)境樣品中微生物單細胞提取與制備、穩定同位素飼喂細胞、單細胞核酸裂解與擴增等環(huán)節的應用。該系統廣譜適用于細菌、古菌、真菌和動(dòng)植物細胞，服務(wù)于涵蓋各種復雜生態(tài)系統的研究和應用。

該工作獲得了中國科學(xué)院“土壤—微生物系統功能及其調控”先導專(zhuān)項、國家自然科學(xué)基金委、青島星賽生物科技有限公司等的支持。

相關(guān)論文信息：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mSystems.00181-21


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